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1. PCR quantitativo em tempo real

Em 1996, a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR em tempo real) foi introduzida pela Applied Biosystems nos Estados Unidos. O qPCR assim chamado do tempo real refere a adição de grupos fluorescentes à reacção do PCR para monitorar continuamente o sinal fluorescente. A ordem de aparecimento e a mudança da intensidade do sinal podem ser usadas para analisar a quantidade inicial do gene alvo em tempo real. A invenção desta tecnologia realiza o salto do PCR qualitativo ao quantitativo.

2. Produtos químicos usados na fluorescência do PCR

Atualmente, o qPCR em tempo real é dividido em duas categorias: corantes fluorescentes e sondas fluorescentes de acordo com os diferentes produtos químicos fluorescentes usados.

3. Corantes usados na fluorescência do PCR

As tinturas fluorescentes são chamadas igualmente tinturas obrigatórias do ADN. A principal molécula corante usada atualmente é SYBR Green I. SYBR Verde Eu posso ligar especificamente ao sulco menor do DNA de fita dupla. Gratuito SYBR Verde I tem quase nenhum sinal fluorescente, mas se liga ao DNA de cadeia dupla. Depois disso, seu sinal de fluorescência pode ser aumentado centenas de vezes. Com o aumento do produto do PCR, a quantidade obrigatória de produto do PCR e da tintura igualmente aumenta, e a intensidade do sinal da fluorescência representa o número de moléculas dobro-encalhadas do ADN.

As vantagens dos corantes fluorescentes são que eles são fáceis de usar, podem ser combinados com qualquer produto PCR e são baratos.

Em geral, o método SYBR Green I é um dos experimentos de qPCR em tempo real mais básicos e comumente usados.

4. Sondas para PCR fluorescência

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

Em circunstâncias normais, a distância espacial entre os dois grupos é muito próxima, e o gene fluorescente não pode fluorescer devido à têmpera. Durante a amplificação por PCR, o primer e a sonda se ligam ao molde ao mesmo tempo, e a posição de ligação da sonda está localizada entre os iniciadores a montante e a jusante.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

A tecnologia de sonda TaqMan resolve o problema da combinação de corantes fluorescentes e amplificação não específica. Após a reação, não há necessidade de detecção de curva de fusão, o que encurta o tempo de teste.

As vantagens da tecnologia da sonda TaqMan são baixo fundo de fluorescência, alta sensibilidade, alta estabilidade de hibridização, boa resolução espectral de fluorescência e alta especificidade.

Devido à alta especificidade das sondas TaqMan, ele pode ser usado para discriminação alélica, especialmente para polimorfismos de genes humanos e para distinguir e quantificar cepas baseadas em SNP.